Identificar por High-Throughput Screening/High Content Screening (HTS/HCS) moléculas capazes de modular a atividade das enzimas UBE2A, ADK e/ou processos relacionados a DDX3X, caracterizar moléculas-alvo (hits) no contexto estrutural, funcional e molecular, visando a prover ferramentas farmacológicas que permitam um avanço no conhecimento acerca do papel dessas proteínas no desenvolvimento e função neuronal e que sirvam como ponto de partida para o desenvolvimento de novos fármacos para DI e/ou TEA.

Produzir as proteínas humanas DDX3X, UBE2A e ADK e seus mutantes com relevância clínica, utilizando sistema de expressão heterólogo;

Purificar as proteínas DDX3X, UBE2A e ADK utilizando técnicas cromatográficas;

Realizar ensaios enzimáticos com as proteínas purificadas para avaliar a função destas;

Adaptar ensaios bioquímicos da UBE2A e ADK para microplacas de 384 poços;

Adaptar ensaios fenotípicos que permitam medir, por microscopia de fluorescência em microplacas de 384 poços, o acúmulo de DDX3X mutante em grânulos de estresse de neuroblastomas humano (SHSY5Y);

Conduzir campanhas de triagem em moldes high throughput screening (HTS) com as enzimas UBE2A e ADK, assim como de high content screening (HCS) com neuroblastomas que produzam DDX3X mutante, utilizando a biblioteca de produtos naturais disponível no LNBio;

Desreplicar e purificar produtos naturais com ação de modulação das enzimas estudadas;

Executar campanha de HTS com uma coleção de 50.000 moléculas de origem sintética, com propriedades físico-químicas adequadas para permear barreira hemato-encefálica, que será adquirida no decorrer do projeto e utilizada nos ensaios relacionados as enzimas UBE2A, DDX3X e ADK;

Selecionar hits prioritários para caracterização estrutural e funcional com as enzimas e células alvo;

Determinar potência dos hits selecionados frente à atividade das enzimas ADK e UBE2A selvagens e/ou mutantes, bem como sobre o fenótipo causado pela DDX3X mutante;

Estabelecer protocolos para determinação estrutural das enzimas alvo em complexo com os hits selecionados, utilizando metodologias de expertise do CNPEM como cristalografia de proteínas, microscopia eletrônica de partículas únicas e/ou ressonância magnética nuclear;

Realizar os experimentos estruturais estabelecidos para obter modelos tridimensionais de alta resolução dos complexos enzima-ligante;

Executar estudos in vitro com células de neuroblastoma humano para avaliar o impacto dos hits oriundos das campanhas de HTS/HCS sobre a viabilidade, replicação e função neuronal.

Serviço